Une introduction aux méthodes de dosage de l'ADN résiduel des cellules hôtes dans les produits biologiques

Les cellules hôtes sont la pierre angulaire des produits biologiques, et les lignées cellulaires de mammifères sont maintenant devenues les hôtes les plus utilisés pour l'expression et la préparation de produits biologiques. Les cellules hôtes courantes comprennent les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), les cellules Vero des reins de singe vert africain et les cellules de rein embryonnaire humain (HEK 293).

Risque d'ADN résiduel de la cellule hôte

Cancérogénicité

Le mécanisme cancérigène primaire deADN résiduel de la cellule hôteEst l'introduction d'oncogènes dominants, tels que MYC et RAS. Ces oncogènes dominants peuvent transformer directement les cellules normales, amenant certaines cellules normales à se différencier en cellules tumorales. Les mutations d'insertion de l'ADN résiduel des cellules hôtes sont également des facteurs cancérigènes potentiels.

Infectivité

L'ADN résiduel des cellules hôtes peut contenir des génomes viraux infectieux, qui peuvent produire des particules virales infectieuses par réplication et amplification de transcription. Par conséquent, le risque d'infectivité de l'ADN résiduel des cellules hôtes pourrait être plus élevé que son risque cancérigène.

Immunogénicité

Parce que l'ADN génomique provenant de sources microbiennes est riche en CpG et en séquences non méthylées, il augmente le risque d'immunogénicité des protéines médicamenteuses recombinantes in vivo. Par exemple, les séquences riches en CpG de bactéries peuvent déclencher des réponses immunitaires médiées par TLR (récepteurs de type Toll).

Méthodes de détection de l'ADN résiduel des cellules hôtes

Hybridation de sonde d'ADN

Dans cette méthode, l'ADN exogène dans l'échantillon d'essai est dénaturé en brins simples et adsorbé sur une membrane en phase solide. Dans certaines conditions, il peut se réhybrider avec des sondes d'ADN simple brin complémentaires marquées avec des marqueurs pour former de l'ADN double brin. Cependant, les résultats de détection de la méthode d'hybridation présentent des écarts significatifs avec le contenu réel d'ADN résiduel de la cellule hôte, et la méthode est instable avec des temps de détection relativement longs.

Coloration fluorescente

Cette méthode utilise des colorants fluorescents à ADN double brin qui se lient spécifiquement à l'ADN double brin pour former des complexes, produisant un signal fluorescent fort lorsqu'il est excité à une longueur d'onde de 480 nm. Le signal fluorescent à 520 nm est détecté à l'aide d'un fluoromètre. L'intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration d'ADN. Cependant, le signal fluorescent de cette méthode est facilement interféré et a une faible spécificité, nécessitant d'éviter la contamination de l'ADN environnemental, et tous les matériaux et réactifs utilisés doivent être sans ADN.

PCR quantitative

Actuellement, la méthode la plus conventionnelle pour détecter l'ADN des cellules hôtes (HCD), cette technique implique une surveillance en temps réel du processus PCR à travers des signaux fluorescents pour analyser quantitativement le modèle. Sur la base de principes chimiques, il peut être divisé en deux types: la méthode de la sonde TaqMan et la méthode du colorant SYBR.

La méthode de sonde TaqMan utilise des sondes oligonucléotidiques spécifiques du gène marquées avec des colorants fluorescents pendant la réaction de PCR pour détecter le produit, tandis que la méthode de colorant SYBR ajoute un excès de colorant fluorescent au système de réaction PCR. Le colorant incorpore spécifiquement dans le double brin d'ADN et émet un signal fluorescent. La méthode de la sonde TaqMan augmente la spécificité grâce à l'étape de reconnaissance de la sonde, tandis que la méthode de colorant SYBR est plus simple et plus simple.